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DNAのメチル化でがんを抑制できる!?具体的な実験方法

https://ja.wikipedia.org/wiki/DNA%E3%83%A1%E3%83%81%E3%83%AB%E5%8C%96

https://ja.wikipedia.org/wiki/DNA%E3%83%A1%E3%83%81%E3%83%AB%E5%8C%96

DNAメチル化は、DNA鎖の塩基の1つにメチル基を付加する反応であり、重要なエピジェネティックな修飾です。

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DNAメチル化は、多くの生物学的現象に関与するプロセスです。たとえば、原核生物では、病原性、細胞周期制御、遺伝子発現、および外因性DNA侵入に対する防御(DNA-宿主特異性)に関与しています。真核生物では、クロマチンの安定性、刷り込み、X染色体の不活性化、および発癌に関与しています。

哺乳類では、DNAメチル化は主にシトシン残基の5番目の炭素で起こり、5-メチルシトシンまたは5-メチルシチジン(5-mC)をもたらします。これは主にCpGジヌクレオチドに見られ、重要なエピジェネティックマーカーです。また、遺伝子発現調節因子であり、遺伝子プロモーター上のメチル化CpGクラスターまたはCpGアイランドが遺伝子の不活性化に関与しています。

DNAメチル化は、DNMT1、DNMT3a、DNMT3bなどのDNAメチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素ファミリーによって実行されます。 DNMT3aおよびDNMT3bは、de novoメチルトランスフェラーゼとしても知られ、以前はメチル化されていなかったCpGをメチル化できます。一方、DNMT1はメンテナンスメチルトランスフェラーゼと呼ばれ、複製中にヘミメチル化されたDNAを修飾します。

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DNAメチル化と脱メチル化
DNAの脱メチル化には、Tet1、Tet2、Tet3などのTetファミリー酵素が関与します。5-mC→5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)→5-ホルミル。 5-ホルミル-シトシン(5-fC)→5-カルボキシ-シトシン(5-caC)→シトシンの連続酸化過程で行われると考えられています。 (図1)。最近、塩基除去修復(BER)経路の解糖系酵素であるTDGも、上記とは異なる経路での脱メチル化に関与していることがわかりました。この経路は、5-hmCの脱アミノ化から生じる可能性のある5-ヒドロキシメチルウラシルを修復することができます。

DNAメチル化を分析するためのアプローチ
多くの方法が考案されていますが、ここではそのうちの3つだけを紹介します。

 

亜硫酸水素ナトリウムの修飾

亜硫酸水素ナトリウム処理は、シトシンのメチル化を分析するための便利なツールの1つです。これにより、DNAのメチル化パターンを特定できます。この手法を次世代シーケンシング(NGS)と組み合わせて使用して、特定の領域だけでなく、ゲノム全体にわたってメチル化マッピングを作成する試みもあります。

バイサルファイト変換の概要スキーム

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DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理すると、シトシン残基(C)が脱アミノ化され、ウラシル(U)に変換されますが、メチル化シトシン残基(mC)はそうではありません。処理後にPCRでシーケンシングを行うと、DNAメチル化が見られない領域では処理前後で配列が異なり、DNAメチル化が見られる領域では処理前後で変化が見られません。

 

配列特異的酵素消化

この方法では、メチル化感受性酵素(基質DNAがメチル化されるとDNA切断活性が低下します)と非メチル化感受性酵素を使用します。次に、DNAシーケンシング、マイクロアレイ、PCR、サザンブロッティングなどと組み合わせて、メチル化領域を特定します。

 

メチル化されたDNAの捕捉/定量化

DNA結合タンパク質やメチル化DNA認識抗体など、メチル化DNAに特異的に結合するタンパク質を利用する方法もあります。

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例えば、特定の抗体をマイクロプレートに固定化することができ、メチル化されたDNAとヒドロキシメチル化されたDNAの組成比をELISAのような方法で測定することができます。 MeDIP(メチル化DNA免疫沈降)と呼ばれる方法もあります。この方法では、メチル化DNA抗体をマイクロビーズに固定し、免疫沈降して収集します。

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