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DNAのマイクロアレイの費用は?結果の見方のコツ

https://www.cellscare.co.jp/idensil-column-sports-gene/1/

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マイクロアレイとは何ですか?

DNAマイクロアレイとは何ですか?
「マイクロアレイ」という用語は、もともと小さな物質の整然とした配置を指します。 「DNAマイクロアレイ」は、微細な物質がDNAの場合に使用される名前ですが、マイクロアレイで最も一般的に使用されている技術であるため、「DNA」は省略され、単に「マイクロアレイ」と呼ばれることがよくあります。です。このマイクロアレイは、オリゴヌクレオチド、cDNA、またはBACでクローン化されたDNAをガラスなどの基板上に高密度に整列および固定するためのツールです。このマイクロアレイ上でサンプルRNAまたはDNAをハイブリダイズさせることにより、遺伝子発現レベル、塩基配列決定、遺伝子変異/ SNP分析、染色体コピー数多型など、RNAまたはDNAのさまざまな定性的および定量的変化を調べます。この技術は1994年から1995年頃に開発されました。

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このようなハイブリダイゼーションを使用した検出方法は、分子生物学の分野でサザンブロットおよびノーザンブロットで長い間使用されてきましたが、これらの方法には、1回の実験で検出できるターゲットが1つしかありません。一方、マイクロアレイ技術は、1回の実験で数万の標的を同時に検出できるため、ゲノム全体にわたる包括的な遺伝子発現解析が可能になります。

 

マイクロアレイの歴史

ガラス基板上でハイブリダイズするマイクロアレイを製造するために、2つの方法が開発されました。 Affymetrixの創設者であるStephenPA Fodorは、1980年代後半に半導体製造で使用されたフォトリソグラフィーとコンビナトリアルケミストリーを組み合わせた、ガラス基板上でペプチドとDNAを直接合成する方法を開発しました

Fodorは、この技術を利用して高密度DNAマイクロアレイの製造の可能性を発見し、1994年に当時所属していたAffymaxから独立したAffymetrixを設立し、マイクロアレイGeneChipsの製造・販売を開始しました。
当時、ガラス基板上で合成されるDNA(オリゴヌクレオチドプローブ)の長さは、合成効率、配列特異性、コストなどを考慮して25merに設定されていました。このガラス基板に搭載されるオリゴヌクレオチドプローブの数は、技術の進歩により表1に示すように改善されました。

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一方、ゲノム研究を行っていたスタンフォード大学のパトリック・O・ブラウンは、1995年にロボットアーム付きスポッターと呼ばれる装置を使って、表面コーティングされたガラス基板(スライドガラス)上にcDNAを発見しました。マイクロアレイの作製方法を開発し、それらを用いた遺伝子発現解析法を報告しました5)、6)。その後、1996年にこの製造方法をインターネット上で公開することにより7)、多くの企業がさまざまなマイクロアレイ製造装置を開発し、1万近くのスポットに取り付けることができる装置も登場しました。
図1に、これら2つのマイクロアレイ製造方法の概略図を示します。 Fodorが開発した手法は、オンチップ合成型またはAffymetrix型と呼ばれています(図1-a)。一方、ブラウンが開発した手法は、スポッティングタイプまたはスタンフォードタイプと呼ばれています

現在、インクジェット印刷技術を応用してDNAを合成するインクジェット型と呼ばれるオンチップ合成型マイクロアレイの製造方法もあります。
アフィメトリクスのマイクロアレイ製造技術は、アプライドバイオシステムズ™クラリオム™DやアプライドバイオシステムズクラリオムSなどの製品のためにサーモフィッシャーサイエンティフィック社に引き継がれました。遺伝子発現解析用の最新のマイクロアレイであるクラリオムDは、600万ものマウントが可能になりました。単一のアレイ上のプローブ。また、このクラリオムDからメインプローブのみをピックアップして開発されたクラリオムSは、昔、メインのアノテーション遺伝子をカバーしながら、1回のアッセイで20,000〜25,000の分析が可能な製品です。マイクロアレイの価格を知っている人のために、それは今驚くほど低価格で提供されています。

 

マイクロアレイ技術の信頼性

マイクロアレイ技術を用いた遺伝子発現解析データが発表されたとき、再現性のあるデータとして入手できるのではないかと考える人もいました。
これに応えて、米国FDAは、再現性、パフォーマンス、データ分析方法などのマイクロアレイの品質を管理するプロジェクト(MicroArray Quality Control Project、一般にMAQCとして知られています)の開始を主導しました。また、RNAサンプル製造会社や研究機関など51の組織がデータ収集に参加しました。その結果は2006年9月号のNatureBiotechnologyにまとめられ、再現性が得られ、異なるプラットフォームで得られた遺伝子リストがよく一致していることが確認されました8)-12)。

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マイクロアレイサンプルの準備方法と発現分析の原理
前述のように、マイクロアレイの製造には2つの方法がありますが、分析方法には1色法と2色法の2種類があります。遺伝子発現解析におけるサンプル準備の流れとともに、それぞれの方法を紹介します。

一色法、二色法ともに、T7RNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加したプライマーと逆転写酵素を用いて出発物質RNAから一本鎖cDNAを合成し、DNAポリメラーゼを用いてT7RNAを使用します。 I.ポリメラーゼのプロモーター配列を含む二本鎖cDNAを合成します。そして、二本鎖cDNAをテンプレートとしたT7RNAポリメラーゼを用いたinvitro転写による調製法により、約100倍の増幅産物を得ることが主流である13)。
ワンカラー法では、2つのターゲットRNAサンプルを1色蛍光色素で標識し、調製した各標識サンプルをマイクロアレイにハイブリダイズさせます。その後、スキャンにより画像データを取得し、各マイクロアレイから得られた信号強度を測定して遺伝子発現レベルを比較します。
一方、2色法は、異なる蛍光色素を使用して2種類のRNAサンプルを標識する方法です。ハイブリダイゼーションの前に両方の標識サンプルを混合した後、競合ハイブリダイゼーションが1つのマイクロアレイで実行されます。私はします。その後、スキャンにより画像データを取得し、発現率を測定します(図2)。

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サンプルで高度に発現した転写産物は多くのプローブに結合し、蛍光強度が増加します。逆に、サンプル中の発現レベルが低い転写産物は、蛍光強度が弱くなります。各プローブの蛍光強度の強度を測定することにより、サンプル中の各転写産物の発現レベルが分析されます。

単色法実験では、使用するマイクロアレイ間で比較分析を行うため、アレイ間で品質にばらつきがなく、分析時にアレイ間補正が必要です。ただし、一連の実験で対照となる対照サンプルのデータを1回だけ取得し、比較分析したいサンプルのデータのみを取得することで、比較分析を行うことができます。 Applied BiosystemsGeneChip™やClariomなどのマイクロアレイは、典型的な単色法です。 2色法を用いた実験では、単一のマイクロアレイで比較を行うため、アレイ間補正の代わりにサンプル間で標識された蛍光色素を交換する色素交換実験などの色素補正が必要です。また、実験を行うたびに対照として対照サンプルを用意する必要があります。

 

マイクロアレイデータ分析

遺伝子発現解析では、取得した画像データから信号強度を定量化し、発現レベルの比較解析を行いますが、マイクロアレイによる遺伝子発現解析では大量のデータを処理するため、専用の解析ソフトウェアを使用する必要があります。

分析ソフトウェアには、フリーソフトウェアTAC(Applied Biosystems Transcriptome Analysis Console)、オープンソースのフリーソフトウェアの統計分析用のプログラミング言語であるRを使用したBioconductor、GenomicsSuite™およびGeneSpringが含まれます。のような有料のものがあります。

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ソフトウェアは研究目的と分析レベルに応じて選択されますが、TACなどの無料ソフトウェアでも、図3(遺伝子を表示)に示すように、スキャッタープロット(サンプル間の遺伝子発現レベルがスキャッタープロットに表示されます)および階層的クラスタリング樹状図で同様の発現パターンを持つ)、経路分析(発現が変化した遺伝子グループが関与する経路を表示)、相互作用ネットワークグラフ(発現が変化した遺伝子とmiRNAの相互関係)(関係の表示)のような図を表示できます。そして、ソフトウェアによって得られた図は、論文にそのまま使用されます。

 

マイクロアレイ技術を用いた応用例

マイクロアレイ技術は、遺伝子発現解析だけでなく、DNAを標的とする際にDNAの1塩基の違いを区別する実験条件を設定することにより、塩基配列解析やジェノタイピングにも使用できます。
表3に、マイクロアレイ技術を使用したアプリケーション例を示します。

目的応用例
遺伝子発現解析mRNAレベルでの異なる状態の細胞と組織の遺伝子発現の違いの比較・成長条件の違いによる植物と微生物のすべての遺伝子発現の比較
・創薬対象分子を探す
・がんの予後や悪性腫瘍の指標となるバイオマーカーを探す
多形分析
(ジェノタイピング)・疾患に関与するゲノム領域の検出
・多様性に関与するヌクレオチド多型の検出・SNPに基づく疾患に対する感受性の評価
・薬理遺伝学に基づく創薬

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染色体コピー数解析・遺伝性疾患に伴う染色体構造変化の検出
・癌遺伝子の増幅、染色体欠失の検出・染色体検査の1つの検査方法
・がんの予後や悪性腫瘍の指標となるバイオマーカーを探す
ベースシーケンス分析
(リシーケンス)・特定のゲノム領域のヌクレオチド配列決定
・病原体の分類・遺伝性疾患における塩基配列変異の検出
・病原体のサブタイピング
このように、マイクロアレイ技術は基礎研究だけでなく、創薬研究、病気の診断・予防法の開発、食品・農業、エネルギー・環境問題対策など、さまざまな分野の研究に活用されています。

マイクロアレイの実験を開始するにはどうすればよいですか?
これまでマイクロアレイの歴史と原理を紹介してきましたが、どのようにしてマイクロアレイの実験を始めますか?
マイクロアレイを分析するには、分析を実行するための機器が必要です。共用設備室に設置される場合もありますので、ご不明な点がございましたら施設にご確認ください。
ただし、機器をお持ちでない場合でも、マイクロアレイの契約分析を行っている会社に依頼することで、サンプルのマイクロアレイデータを取得することができます。
さらに、マイクロアレイの契約分析を検討している方のために、Thermo FisherScientificは試用版の有料分析サービスも提供しています。ご興味のある方はお問い合わせください。

契約分析をお考えの方は、マイクロアレイの「契約分析の際の注意点」もご覧ください。

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